Testy RetroFel

NOVÉ MOŽNOSTI DIAGNOSTIKY FeLV

Cílem této zprávy bylo posoudit proveditelnost a užitečnost sérologické diagnostiky viru kočičí leukemie (FeLV). Při analýze různých virových proteinů bylo zjištěno, že z hlediska sérologické diagnostiky infekce FeLV je možné považovat za slibné kandidáty produkt env genu FeLV (SU) a obalový transmembránový protein p15E. Proto jsme posuzovali p15E a tři další antigeny FeLV, jmenovitě rekombinantní produkt genu env, celý FeLV a krátký peptid z transmembránového proteinu FeLV, a to s cílem zjistit, zda je možné tyto antigeny využít k detekci infekce FeLV. Za účelem posouzení možné expozice koček viru FeLV jsme pomocí enzymových imunoanalýz (ELISA) testovali vzorky séra a plazmy experimentálně a přirozeně infikovaných a vakcinovaných koček na přítomnost protilátek proti těmto antigenům. Sérologické výsledky jsme porovnali s výsledky testu na p27 a testu PCR v reálném čase na provirus. Zjistili jsme, že p15E vykazoval u experimentálně infikovaných koček diagnostickou senzitivitu 95,7 % a specificitu 100 %. U přirozeně infikovaných koček vykazoval p15E diagnostickou senzitivitu 77,1 % a specificitu 85,6 %. U vakcinovaných koček byla zjištěna minimální hladina protilátek proti p15E, z čehož lze usuzovat, že protilátky proti p15E poukazují spíše na infekci než na vakcinaci. Ostatní antigeny se ukázaly jako příliš nespecifické. Nižší specificita u koček vystavených působení viru FeLV v terénních podmínkách může být důsledkem faktu, že některé kočky byly nakaženy a proběhla u nich sérokonverze za nepřítomnosti detekovatelných nukleových kyselin viru v plazmě. Dospěli jsme k závěru, že sérologické vyšetření p15E se může stát užitečným nástrojem diagnostiky infekce a že v některých případech může nahradit testy PCR.

Infekce virem kočičí leukemie (FeLV) má veterinární relevanci, i když její význam se u většiny studovaných populací liší. Výsledek onemocnění u infikovaných koček obvykle závisí na přítomnosti proviru a virového antigenu v krvi. Jedná se nicméně vysoce nepředvídatelný údaj, neboť je ovlivňován faktory, jako je podtyp viru a věk a celková tělesná kondice kočky.

Diagnostika infekce FeLV je založena převážně na průkazu viru nebo virového antigenu v plazmě, séru nebo plné krvi. Nejčastěji používané sérologické testy prokazují přítomnost buď antigenu p27 pomocí enzymového imunotestu (ELISA), nebo strukturálních antigenů FeLV v cytoplazmě infikovaných leukocytů a destiček pomocí imunofluorescenčního testu protilátek (IFA). Přítomnost specifických protilátek proti FeLV detekuje také metoda Western blot. Mezi jiné než sérologické metody patří izolace viru nebo PCR k detekci provirové (FeLV DNA) nebo virové (FeLV RNA) nálože. Jelikož je však provádění většiny těchto testů pracné a/nebo nákladné, nejsou všechny vhodné ke klinickému využití.

Je známo, že u nakažených koček může dojít k vyvolání protilátek proti různým složkám FeLV. Zatím však platí, že detekce protilátek proti FeLV má omezený význam, a to z několika důvodů: zaprvé, neexistují důvody, že spolehlivý průkaz protilátek může predikovat infekci FeLV; zadruhé, není známo, které protilátky jsou vhodné; a zatřetí, endogenní FeLV (enFeLV) je v populacích koček velmi rozšířený, neboť v každé buňce každé kočky lze nalézt více kopií enFeLV. Jelikož enFeLV není v plné míře tolerován imunitním systémem, dochází k vyvolání protilátek, které nejsou odlišitelné od protilátek proti exogennímu FeLV. Endogenní od exogenního FeLV dokáže rozlišit jen několik metod, např. PCR v reálném čase. Proto zatím nejsou protilátky proti FeLV považovány za užitečný diagnostický parametr. Autorům několika studií se navíc nepodařilo prokázat dostatečnou protilátkovou odpověď proti různým epitopům FeLV. Fontenot a kol. analyzovali reaktivitu predikované transmembránové imunodominantní domény FeLV (Imd-TM peptid) a zkoumali její potenciál coby diagnostické reagencie pro sérologické vyšetření. Bylo zjištěno, že tento peptid vykazoval pouze zanedbatelnou reaktivitu při použití séra koček nakažených FeLV, z čehož vyplynulo, že Imd-TM peptid není vhodný k diagnostice FeLV. Langhammer a kol. vyrobili rekombinantní p15E FeLV a prokázali, že kočky nakažené FeLV si vytvořily protilátky proti p15E, i když reakce v testech ELISA byly slabé. Mapováním epitopů odhalili celou škálu epitopů rozpoznaných v séru zvířat nakažených FeLV, včetně epitopů prokázaných v séru koček imunizovaných proti p15E (slabší reakce). Dospěli k závěru, že přirozená infekce FeLV vede ke slabé indukci vázání protilátek specifických pro p15E a slabé indukci neutralizujících protilátek. Lutz a kol. však kvalitativně a kvantitativně porovnávali hladiny protilátek proti různým složkám FeLV u přirozeně infikovaných koček a zjistili, že p15E vykazoval silnou antigenicitu.

Zjistili, že kočky, které byly po infekci imunní nebo viremické, vykazovaly zvýšené hladiny protilátek proti p15E. Dospěli k závěru, že protilátky proti p15E poukazují na infekci FeLV, nejspíš se však jen málo podílejí na neutralizaci viru. S přihlédnutím k těmto výsledkům jsme vyslovili hypotézu, že transmembránový (TM) obalový protein p15E viru FeLV a další virové proteiny mohou být potenciálně užitečným sérologickým diagnostickým nástrojem. Proto jsme posuzovali p15E, rekombinantní produkt env genu viru FeLV (p45), celý virus (FL-74) a krátký syntetický peptid (EPIK211) odvozený od TM jednotky obalového proteinu viru FeLV. Pomocí nepřímé ELISA jsme prováděli systematický screening vzorků séra od přirozeně a experimentálně infikovaných a imunizovaných koček. U každého vzorku byly známy výsledky testu PCR na provirus a testu p27 v plazmě, stejně jako status imunizace.

MATERIÁL A METODY
Antigeny pro testy ELISA. Hodnotili jsme čtyři antigenní produkty.

• p15E
• p45
• Celý virus (FL-74)

Vzorky séra a plazmy. Použili jsme vzorky séra a plazmy od různých laboratorních zvířat a také od zvířat soukromých majitelů.

Vzorky z první studie (9/skupinu), provedené v roce 2006, jsou definovány následovně. Skupina 1 zahrnovala nevakcinovaná kontrolní zvířata. Kočky ve skupině 2 dostaly vakcínu Eurifel (nyní známou jako Purevax; Merial, Lyon, Francie). Eurifel je neadjuvantní vakcína využívající jako vektor živý canarypoxvirus (ALVAC) obsahující env a gag geny FeLV-A a část genu pol. Skupina 3 dostala přípravek Fel-O-Vax LV-K IV (Fort Dodge, IA, USA), což je polyvalentní vakcína obsahující usmrcený celý virus FeLV. Vakcíny byly aplikovány dvakrát subkutánní injekcí. Čtyři týdny po druhé vakcinaci byla každá kočka podrobena čelenži kmenem FeLV-A/Glasgow-1.

Vzorky ze druhé vakcinační studie (15/skupinu) (H. Lutz a R. HofmannLehmann, nepublikované údaje) jsou definovány následovně. Skupina 1 zahrnovala nevakcinovaná kontrolní zvířata. Kočky ve skupině 2 byly očkované vakcínou Fe-vaxyn FeLV (Solvay Animal Health, Inc., MN, USA), která obsahuje inaktivovaný (neboli usmrcený) antigen. Kočky ve skupině 3 dostaly vakcínu Fel-O-Vax LV-KIV (Fort Dodge) a kočky ve skupině 4 vakcínu Leucogen (Virbac). Vakcíny byly aplikovány dvakrát subkutánní injekcí. Čtyři týdny po druhé vakcinaci byla každá kočka podrobena čelenži kmenem FeLV-A/Glasgow-1.

V obou studiích byly vzorky krve odebrány před vakcinací a v den vystavení čelenži. Poté byly vzorky odebírány každý týden, a to až do týdne 15.

Použili jsme také vzorky séra od koček soukromých majitelů (n = 294) žijících na území Švýcarska. Tyto vzorky jsme měli k dispozici v našich laboratořích – byly odebrány v období do dubna 2004 do ledna 2005. Veterináři, kteří nám tyto vzorky poskytli, nám předali také vakcinační záznamy týkající se jednotlivých koček. U všech vzorků, které jsme testovali, jsme znali výsledky analýz PCR (provirus) a ELISA (p27). Pro všechny pokusy s výzkumnými zvířaty získal ředitel laboratoře (H. Lutz) od státního veterinárního úřadu potřebná povolení pro práci se zvířaty. Všechny experimenty byly provedeny v plném souladu se všemi příslušnými právními požadavky.

Enzymové imunoanalýzy. Testy ELISA byly v zásadě založeny na metodách popsaných dříve.

PCR. Provirové sekvence exogenního FeLV přítomné v krevních leukocytech byly detekovány a kvantifikovány pomocí PCR v reálném čase, a to za podmínek popsaných dříve.

Analýza dat a statistiky. Hodnoty OD ELISA byly použity jako standardizované hodnoty OD: (Hodnota OD [vzorek] – hodnota OD [negativní kontrola]/(hodnota OD [pozitivní kontrola] – hodnota OD [negativní kontrola]).

VÝSLEDKY

Čistota rekombinantního p15E. Na rozdíl od ostatních tří antigenů, které již byly k testu protilátek pomocí ELISA k dispozici, transmembránový protein p15E viru FeLV musel být specificky syntetizován a purifikován v naší laboratoři. Po naklonování v buňkách E. coli a průkazu přítomnosti produktu pomocí Western blot analýzy byl p15E intenzivně purifikován a testován na možné kontaminanty E. coli.

Hladiny protilátek u experimentálně infikovaných koček. K vyhodnocení diagnostické užitečnosti různých antigenů FeLV a k porovnání experimentálně a přirozeně infikovaných koček byla použita analýza křivky ROC (receiver operating characteristic), která vyjadřuje poměr skutečně pozitivních výsledků (senzitivita) a falešně pozitivních výsledků (1-specificita).

V první analýze ROC u experimentálně infikovaných zvířat byly stanoveny mezní hodnoty vedoucí k optimální specificitě a senzitivitě testu s cílem odlišit neinfikované, provirus-negativní a SPF (bez specifických patogenů) kočky od infikovaných koček pozitivních na provirus (po sérokonverzi). S cílem dosáhnout definovaného a srovnatelného souboru koček stejného věku jsme z této studie vyřadili starší SPF kočky (n=10).

Antigen p15E vykazoval vynikající shodu, když se pohyboval kolem levého i horního okraje prostoru ROC. Optimální mezní hodnota OD 0,0495 představovala nejlepší možný kompromis mezi senzitivitou 95,7% a specificitou ve výši 100%.

Optimální mezní hodnota (-0,039) pro EPK211 vykazovala senzitivitu 65,7% a specificitu 81,1%, zatímco u p45 (mezní hodnota 0,016) byla senzitivita 80% a specificita 88,9%. Celý virus vykazoval senzitivitu 65,7% a specificitu 81,1% při mezní hodnotě -0,007.

Cohenovy koeficienty kappa, které představují o náhodu upravenou míru shody mezi dvěma soubory kategorizovaných dat, odhalily téměř dokonalou úroveň shody (k = 0,96) mezi p15E a provirem (Tabulka 1). Shody mezi provirem a p45, celým virem (FL-74) a EPK211 byly nižší a pohybovaly se v intervalu od 0,47 do 0,70. Shoda mezi páry antigenů byla uspokojivá až dobrá, nicméně nižší než shoda mezi p15E a provirem.

Hladiny protilátek u přirozeně infikovaných koček soukromých majitelů.

U koček přirozeně infikovaných virem FeLV jsme prováděli analýzy ROC s využitím proviru jako zlatého standardu. Výsledky poukazují na dobrý průběh křivky pro antigen p15E, který ostře kontrastuje s průběhem křivky u ostatních antigenů. Cohenovy koeficienty kappa (specificita ≥80%) byly nižší než u experimentálně infikovaných koček, což odpovídalo rozdílům mezi těmito dvěma soubory dat posuzovanými pomocí analýz ROC. Nejlepší shody dosáhl p15E při vynesení proti proviru (k = 0,55) (Tabulka 1). Naproti tomu ostatní dvojice antigenů a dvojice provirus a antigeny dosahovaly hodnot pouze 0,08 až 0,42, a byly tedy zjevně nevyhovující. Tyto výsledky naznačují, že shoda mezi p15E a provirem je mnohem lepší než v případě kombinací p15E s jinými antigeny.

Hladiny protilátek u experimentálně vakcinovaných koček. S cílem zjistit hladiny protilátek také u vakcinovaných koček jsme testovali vzorky séra mladých 8-týdenních SPF koček, a to jednou před vakcinací a poté ještě jednou po druhé dávce vakcíny, ovšem před čelenžní infekcí.

Hladiny protilátek u vakcinovaných koček soukromých majitelů. Ze všech koček soukromých majitelů, které byly negativní na provirus, bylo vakcinováno 50 zvířat. Osm koček bylo z této studie vyřazeno, neboť kromě toho, že byly imunizované, byly také pozitivní na provirus nebo dokonce viremické. Ze všech koček, které přicházely v úvahu pro tuto studii, dostalo 98% vakcínu Leucogen, většinou podanou v kombinaci s vakcínou Feligen (proti kočičí panleukopenii a rinotracheitidě/kaliciviróze) (Virbac Schweiz AG, Glattbrugg, Švýcarsko). Výsledky (Obr. 2) odhalily, že protilátkové reakce byly jednoznačně vyšší při použití antigenů p45 (70 %), celého viru (42%) a EPK211 (24 %). Celá podjednotka TM (p15E) vykazovala nízkou reaktivitu u vakcinovaných koček a k překročení mezní hodnoty došlo v 16% případů.

DISKUSE

Tato studie prokázala, že obalový TM protein p15E viru FeLV je slibným kandidátem pro účely sérologické diagnostiky. Při vývoji nového diagnostického testu založeného na specifických protilátkách proti FeLV je nutné definovat kritickou mez. Hladina protilátek překračující tuto mezní hodnotu by pak predikovala jakýkoliv kontakt s FeLV, nižší hladina by predikovala naivitu zvířete vůči FeLV. Proto jsme se v této studii zaměřili na screening protilátek proti čtyřem různým antigenům FeLV u koček naivních vůči FeLV, koček infikovaných virem FeLV a koček imunizovaných proti FeLV. Na základě výsledků jsme definovali mezní hodnotu, která odlišuje kočky, jež se s virem FeLV setkaly, od koček vůči tomuto viru naivních. Pro porovnání našich výsledků ELISA jsme použili zavedený zlatý standard v podobě testování PCR v reálném čase.

První výsledky zjištěné u experimentálně infikovaných a vakcinovaných koček poskytly důkazy o platnosti principů studie.

Pracovali jsme s laboratorními kočkami, neboť u těchto zvířat známe historii infekce a jejich chov probíhá v definovaném SPF prostředí bez jakýchkoliv vnějších vlivů – navíc se jedná o jedince definovaného věku, pohlaví a plemene. U těchto zvířat je také možné přesně zvolit dobu čelenže vůči viru FeLV, podání vakcíny nebo odběru vzorků. Testy odhalily, že antigenem s nejvyšším diagnostickým potenciálem byl p15E, který vykazoval diagnostickou senzitivitu 95,7 % a specificitu 100 %. Ostatní antigeny (EPK211, FL-74 a p45) v tomto smyslu nebyly vhodné.

Pro posouzení diagnostické účinnosti antigenů u přirozeně exponovaných koček v terénu jsme pracovali s daty o jejich virémii (p27) a pozitivitě na provirus (PCR) a také se záznamy o jejich imunizaci. U populace koček z terénu jsme však řadu faktorů neměli pod kontrolou nebo jsme je vůbec neznali, a to kvůli zvýšené interakci těchto zvířat s okolním prostředím. Mezi tyto faktory patří věk koček, možná vícečetná imunizace proti jiným virům než FeLV a jakákoli onemocnění, kterými kočky aktuálně trpěly nebo které prodělaly v minulosti. Další problém spočíval v tom, že jsme neměli žádné záznamy o tom, kolikrát byly tyto kočky vystaveny působení viru FeLV a jeho různým podtypům, zejména pokud se jednalo o toulavé kočky nebo kočky z útulku. Všechny tyto faktory vedly k tomu, že imunitní stav těchto koček byl spíše nejasný. Museli jsme například vyřadit pět koček, které byly vakcinované, zároveň však byly pozitivní na provirus (negativní na p27). Vyřadili jsme také tři kočky, které byly očkované, avšak byly pozitivní na p27 (tj. byly viremické). Nebylo tedy jasné, zda oněch pět koček pozitivních na provirus bylo imunních kvůli infekci nebo vakcinaci a zda výše zmíněné tři kočky pozitivní na p27 se staly viremickými kvůli selhání vakcíny nebo zda byly očkovány až poté, co se již ve fázi viremie nacházely.

Prahová hodnota u těchto vzorků byla podle očekávání vyšší. Diagnostická senzitivita a specificita byla nižší než u vzorků pocházejících z jasně definované populace laboratorních koček.

Navzdory složitějším podmínkám u koček z terénu vykazoval p15E dobrou diagnostickou senzitivitu 77,1 % a specificitu 85,6 %. Relativně nízká specificita 85,6 % by pravděpodobně byla mnohem vyšší, kdyby byla senzitivnější metoda PCR, která byla použita jako zlatý standard průkazu infekce. Expozice vůči FeLV může vést k infekci a sérokonverzi i za nepřítomnosti pozitivních výsledků na p27 a pozitivních výsledků PCR testu vzorků plazmy nebo séra a plné krve. Autoři těchto dvou studií prokázali, že na rozdíl od experimentální infekce vyvolané injekčně, nazální nebo perorální expozice FeLV může vést k sérokonverzi a infekci několika orgánů, při malém postižení kostní dřeně. Pokud by byly v naší studii k dispozici výsledky PCR testů vzorků orgánů od koček soukromých majitelů, specificita by byla mnohem vyšší. Prokázání protilátek proti p15E se proto jeví jako senzitivnější parametr minulého kontaktu s FeLV než sebecitlivější PCR postupy provedené se vzorky krve. Naše výsledky naznačují, že průkaz protilátek proti p15E se může v budoucnu stát relevantním diagnostickým parametrem expozice vůči viru FeLV. Jak už jsme zmínili, u koček soukromých majitelů jsme museli kvůli podmínkám, které se lišily od podmínek u experimentálně infikovaných koček, upravit mezní hodnoty, abychom dosáhli optimální rovnováhy mezi diagnostickou senzitivitou a specificitou. Pokud by byl protilátkový test založený na antigenu p15E vyvíjen pro účely klinické veterinární medicíny, bylo by pro stanovení optimální mezní hodnoty nutné vyšetřit velké množství koček soukromých majitelů. Naše výsledky jsou v souladu se závěry dříve publikované studie, jejíž autoři zjistili významné hladiny protilátek proti FeLV p15E po infekci FeLV. Na druhé straně jsou tyto výsledky v příkrém rozporu s výsledky autorů Fontenot a kol. a Langhammer a kol.

Předpokládáme, že nesoulad s výsledky autorů Fontenot a kol. a Langhammer a kol. lze vysvětlit tím, že tito autoři prováděli testy se syntetickými peptidy, jejichž tvar se liší od trojrozměrného tvaru celého proteinu. Proto tyto peptidy nemusely být rozpoznány protilátkami vyvolanými virovým proteinem.

Shodu mezi dvěma antigeny jsme posuzovali pomocí Cohenových koeficientů kappa, které jsme použili také k porovnání nového testu ELISA se zavedeným referenčním testem (tj. PCR v reálném čase), který ve studii sloužil jako zlatý standard. Vysoké hodnoty kappa poukazují na silnou shodu mezi těmito dvěma testy. Slabá shoda mezi čtyřmi antigeny byla v příkrém rozporu s téměř dokonalou shodou mezi p15E a provirem u experimentálně infikovaných koček a dobrou shodou mezi p15E a provirem u koček z terénu. Je možné, že tyto výsledky by mohly být jedním z prvních krůčků k částečnému nahrazování dražšího testu PCR.

Očekávali jsme, že u některých koček může přítomnost protilátek proti enFeLV interferovat s výsledky vyvolanými infekcí exogenním FeLV. Nicméně test p15E ELISA nevykázal zvýšené hodnoty protilátek u žádné z FeLV-naivních SPF koček, z čehož plyne, že test není negativně ovlivněn protilátkami proti enFeLV, který je ve více kopiích obsažen v každé buňce každé kočky. Je však třeba vzít v úvahu možnost, že některá plemena koček mohou mít zvýšené hladiny protilátek proti enFeLV.

Prokázali jsme, že téměř u všech koček došlo po kontaktu s FeLV k sérokonverzi, a podařilo se nám potvrdit prostřednictvím výsledků pozitivity na p15E, že pravděpodobnost nakažení virem FeLV je vysoká i u koček negativních na p27. Nicméně p15E nedokázal odlišit viremické kočky od imunních koček, což naznačuje, že pro diagnostiku viremie nadále potřebujeme p27. Snadno si lze představit ambulantní testovací zařízení, v němž bude test antigenu p27 umístěn na nízké laterální testovací membráně vedle testovacího pole p15E. Je velmi pravděpodobné, že kočka s negativním výsledkem p27 a negativním výsledkem p15E nikdy nebyla v kontaktu s FeLV. Naproti tomu negativní výsledek p27 a pozitivní výsledek p15E naznačuje, že kočka není viremická/antigenemická, byla však v kontaktu s FeLV a může mít virus někde v těle. Předtím, než je taková kočka zařazena do domácnosti s více kočkami, je třeba u ní dále testovat příznaky latentní infekce, a to přinejmenším vyšetřením krevního vzorku pomocí PCR a/nebo PCR spojenou s reverzní transkripcí (RT-PCR). Je-li výsledek PCR nebo RT-PCR negativní, latentní virová nálož může být skutečně nízká.

Protilátkový test může detekovat nejen nakažené a naivní kočky, ale také kočky imunizované. Kočka s hodnotou p15E přesahující mezní hodnotu byla podle všeho vystavena působení viru FeLV (pokud je výsledek p27 ELISA negativní). Jelikož pozitivní výsledek na p15E automaticky neznamená imunitu vůči FeLV, měly by být v případě potřeby vakcinovány kočky s pozitivním i negativním výsledkem na p15E.

ZÁVĚR

Cílem této studie vylo vyvinout nový sérologický test, který prokáže, zda kočka byla nebo nebyla v kontaktu s FeLV. Za tímto účelem jsme posuzovali různé antigeny FeLV. Bylo zjištěno, že p15E FeLV je užitečný pro odlišení infikovaných a neinfikovaných zvířat. Tento antigen nicméně není užitečný pro jednoznačný průkaz vakcinace, neboť hladiny protilátek většiny vakcinovaných koček soukromých majitelů byly nižší než práh vypočítaný pro FeLV naivní kočky. Proto p15E poukazuje spíše na infekci než na vakcinaci, což je v souladu s předchozími poznatky. Na základě výsledků naší studie jsme dospěli k závěru, že sérologická diagnostika založená na antigenu p15E může skutečně pomoci při posouzení infekčního statutu koček a že může částečně nahradit pracné či nákladné diagnostické techniky, jako je např. PCR.

PODĚKOVÁNÍ

Naše poděkování zasluhují M. Wittenbrink za poskytnutí séra E. coli, A. Gomes-Keller, C. Geret, Pfizer (Kent, Velká Británie), Merial (Lyon, Francie) a Virbac (Carros, Francie) za laskavé poskytnutí vzorky plazmy a séra koček, S. Wellnitz (RedBiotec) a O. Sonzogni za technickou podporu, T. Meili Prodan za syntetizování p15E a společnost EspiKem Srl (Florencie, Itálie) za syntetizování peptidu EPK211. Poděkování patří také mnoha veterinárním lékařům ve Švýcarsku, kteří nám velkoryse poskytli informace o vakcinaci koček klientů jejich praxí.

Tato práce byla podpořena grantem nadace Promedica Stiftung, Chur, Švýcarsko. Studie byla provedena s využitím logistických služeb Centra klinických studií na fakultě Vetsuisse Univerzity Curych ve Švýcarsku.

H. L. inicioval studii. E. B. a H. L. naplánovali a navrhli experimenty.
E. B. provedla experimenty. J. H. navrhl experimenty pro syntézu p15E.
S. H. provedla statistické analýzy. Všichni autoři se podíleli na analyzování dat, psaní článku a čtení a schválení konečného rukopisu.

Prohlašujeme, že nemáme žádný střet zájmů.

POUŽITÁ LITERATURA

Reference a článek v plné verzi je k dispozici ve společnosti Cymedica na vyžádání.